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5 novembre 2009
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Mise sous Spip : 25/03/10. Y. Gille.

Sommaire


1. Principes fondamentaux

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- 1.1. L’absorption moléculaire

De nombreuses molécules en solution possèdent un spectre d’absorption c’est-à-dire qu’elles absorbent plus ou moins le rayonnement lumineux à différentes longueurs d’onde qui constituent le « spectre ».

Exemple :

Dans la figure ci-dessous, on observe que la chlorophylle « a » absorbe particulièrement le rayonnement de longueur d’onde proche de 430 nm ainsi que celui d’une longueur d’onde proche de 660 nm.

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Figure n°1 : spectre absorption de la chlorophylle a

Cette propriété qu’ont certaines molécules d’absorber la lumière d’une longueur d’onde donnée, de façon plus ou moins spécifique, est mise à profit pour réaliser leur dosage.


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- 1.2. Relation entre densité optique et concentration

La photométrie d’absorption est la mesure de l’absorption d’un rayonnement monochromatique (c’est-à-dire d’une longueur d’onde donnée) par une molécule en solution.

Cette propriété d’absorption est utilisée pour mesurer la concentration de cette molécule.

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On mesure l’absorbance (A), ou densité optique (DO) :

DO = A = log Io / I

Io : intensité du rayonnement incident
I : intensité du rayonnement transmis

Dans certaines conditions de concentration, la DO est proportionnelle à la concentration de la molécule en solution. Cette relation est exprimée par la loi de Beer Lambert

DO =A = log Io / I= εlc

ε = coefficient d’extinction molaire : constante caractéristique d’un composé à une longueur d’onde donnée
l : parcours optique de la cuve de mesure (largeur de la cuve) : si la cuve mesure 1 cm, l = 1
c : concentration du composé absorbant


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- 1.3. Représentation graphique de cette relation

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Figure 2 : représentation graphique de la relation DO / concentration

On voit que la DO est proportionnelle à la concentration, et que la relation entre la DO et la concentration est linéaire, jusqu’ à une concentration qui est la limite de linéarité.


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- 1.4. Longueurs d’onde du rayonnement incident :

Le choix de la longueur d’onde dépend de la molécule à doser ou, plus souvent, de la molécule colorée, dite « chromophore », produite par la réaction mise en jeu dans le dosage. On choisira une longueur d’onde absorbée de façon importante par cette molécule chromophore et autant que possible de façon spécifique.

- Longueur d’onde UV : λ < 400 nm
- Longueur d’onde visible : λ 400 à 700 nm (absorption du violet et du bleu entre 400 et 500, du vert, du jaune et du orange entre 500 et 600, du rouge puis de l’infra-rouge au-delà).

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Figure 3 : gamme des longueurs d’onde


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2. Schéma d’un spectrophotomètre :

Un spectrophotomètre est un appareil dans lequel circule un rayon lumineux.

  1. La source lumineuse émet une lumière polychromatique (lumière blanche)
    • Lampe à filament de tungstène ou tungstène halogène : visible et proche UV
    • Lampe au deutérium : UV
  2. Un dispositif appelé monochromateur permet de sélectionner 1 longueur d’onde
    • Le monochromateur peut être un prisme ou un réseau
    • Il peut être remplacé par des filtres interchangeables permettant de sélectionner une longueur d’onde en arrêtant toutes les autres.
  3. Les autres longueurs d’onde sont dispersées par un jeu de fentes et miroirs. Le rayon lumineux devient monochromatique
  4. Le rayon monochromatique traverse une cuve de lecture dans laquelle se trouve la solution contenant le composé à doser.
    • UV : cuve en quartz
    • Visible et proche UV : cuve en verre
    • Matières plastiques de qualité variable
  5. Une partie du rayon est absorbée par la solution. Le reste continue son chemin jusqu’à un photodétecteur relié à un système électronique permettant de l’amplifier (photomultiplicateur) et de le quantifier.
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Figure 4 : schéma d’un spectrophotomètre


3. Réalisation d’un dosage biochimique photométrique


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- 3.1. Réaction chimique mise en jeu / Sélection de la longueur d’onde

De nombreux dosages photométriques biochimiques impliquent l’apparition ou la disparition d’un composé chromophore (qui absorbe à une longueur d’onde donnée) à la suite d’une réaction enzymatique ou physicochimique mettant en jeu le composé à doser.

Exemple :
(NB :Pour illustrer les points importants d’un dosage photométrique, nous allons prendre un exemple simple de dosage : le dosage du glucose sérique par la méthode à la glucose oxydase)

- Dosage du glucose à la glucose oxydase

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Figure 5 : schéma des réactions mises en jeu lors du dosage du glucose par la glucose oxydase

  1. Le glucose est transformé en acide gluconique grâce à la glucose oxydase. Cette réaction consomme de l’oxygène (02) et produit de l’eau oxygénée (H2O2)
  2. L’ H2O2 permet à une peroxydase de transformer une substance chromogène pour la rendre chromophore. Cette substance chromophore absorbe à une longueur d’onde de 510 nm.
    C’est la mesure de cette absorption qui permet le dosage du glucose. On désigne communément l’absorption par le terme « densité optique » ou DO.

La longueur d’onde choisie dépend donc du spectre d’absorption du chromophore utilisé, et correspond en général à un de ses maxima d’absorption (Cf. § 1.1. L’absorption moléculaire).


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- 3.2. Etapes du dosage

Etapes habituelles de l’utilisation d’un spectrophotomètre :

- Mise sous tension du photomètre ; respecter le temps nécessaire de chauffe (stabilisation de l’intensité lumineuse) avant utilisation.
- Sélection de la longueur d’onde
- Réglage du 0% d’absorbance (facultatif)
- Réalisation de l’étalonnage
- Contrôle de qualité
- Dosage des échantillons


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  • 3.2.1. Réalisation de la réaction

On mélange l’échantillon à doser avec une solution contenant les réactifs. L’ensemble constitue le mélange réactionnel. C’est sur ce mélange que l’on va mesurer la DO.

Mode opératoire du dosage de glucose à la glucose oxydase :
On mélange 50 µl d’échantillon à 1 ml de solution réactive.
La totalité ou une partie du mélange réactionnel est placé dans une cuve dans laquelle on va mesurer la DO.


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  • 3.2.2. L’étalonnage / la calibration

En biochimie, il est généralement nécessaire d’étalonner (ou de calibrer) la méthode de dosage.
Il s’agit de comparer la DO des échantillons à tester avec celle d’une solution dont on connaît la concentration avec précision et que l’on appelle étalon.
La concentration de l’étalon a été mesurée avec une méthode de référence.
On peut utiliser différentes dilutions de cet étalon et ainsi obtenir une « gamme d’étalonnage ». Il est également possible d’utiliser l’eau pure (obtenue par distillation et/ou déminéralisation) comme un étalon de valeur nulle.

Exemple d’une gamme d’étalonnage pour le dosage du glucose :

On dispose d’une solution étalon de glucose de concentration Cet = 2g/l
Dans 1 tube, on prépare une dilution au demi de l’étalon (100 µl étalon + 100 µl d’eau) dont la concentration est donc 1 g/l

On prépare une galerie de 3 tubes E2, E1 et E0

E2 50 µl Etalon pur 2,0
E1 50 µl Etalon dilué au ½ 1,0
E0 50 µl Eau distillée 0,0

On ajoute dans chaque tube 1 ml de réactif de glucose oxydase (qui contient l’ensemble des éléments nécessaires à la réaction ci-dessus).
On mesure les DO de chaque tube grâce au photomètre réglé à la longueur d’onde de 505 nm.
On obtient les DO suivantes

Contenu du tube
E2 50 µl Etalon pur + 1 ml réactif 2,0 1,58
E1 50 µl Etalon dilué au ½ + 1 ml réactif 1,0 0,88
E0 50 µl Eau distillée + 1 ml réactif 0,0 0,03

Sur du papier millimétré on reporte les valeurs des DO en fonction de la concentration et on obtient la droite d’étalonnage.

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Figure 6 : droite d’étalonnage


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  • 3.2.3. Le contrôle de qualité interne

Un contrôle de qualité interne (CQI) est un échantillon de concentration connue, dont la nature est si possible proche de celle des échantillons (plasma ou sérum, urine). Il sert à vérifier que l’étalonnage est correct et garantit donc que les résultats obtenus avec les échantillons seront également fiables.
La concentration du CQI est connue mais, à la différence avec l’étalon, elle n’a pas été mesurée avec une méthode de référence mais avec une ou plusieurs méthodes usuelles dont, si possible, celle que l’on utilise. Par conséquent, on n’indique pas “la” valeur exacte d’un CQI mais une plage de valeurs acceptables.

Exemple : on dispose d’un CQI dont la valeur est comprise entre 0,9 et 1,1 g/l. On place 50 µl de ce contrôle dans un tube. On ajoute 1ml de réactif. On lit au photomètre et on obtient une DO de 0,84.
On reporte cette valeur de DO sur la droite d’étalonnage tracée précédemment (point rouge ci-dessous) et on obtient une valeur de concentration de 0,98 g/l

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Figure 7 : droite d’étalonnage et CQI

Contenu du tube Concentration (g/l) DO
E2 50 µl Etalon pur + 1 ml réactif 2,0 1,58
E1 50 µl Etalon dilué au ½ + 1 ml réactif 1,0 0,88
E0 50 µl Eau distillée + 1 ml réactif 0,0 0,03
Ct 50 µl CQI + 1 ml réactif 0,98 0,84

0,98 est compris entre 0,9 et 1,1. La valeur trouvée du CQI est dans la plage acceptable. Le contrôle est bon, la calibration est acceptée et on peut procéder au dosage du glucose dans les échantillons provenant des patients.


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  • 3.2.4. L’analyse des échantillons

Dans un tube, on mélange 50 µl de sérum d’un patient à 1ml de réactif. On mesure la DO que l’on reporte sur la droite d’étalonnage afin de déterminer la concentration.

Par exemple, pour le plasma du patient P1, on observe une DO de 0,68 et pour le patient P2, on obtient une DO de 1,24.
On reporte ces mesures sur la droite d’étalonnage (points verts) et on obtient les concentrations respectives de 0,78 g/l et 1,46 g/l

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Figure 8 : droite d’étalonnage et mesure des serums des patients

Contenu du tube Concentration (g/l) DO
E2 50 µl Etalon pur + 1 ml réactif 2,0 1,58
E1 50 µl Etalon dilué au ½ + 1 ml réactif 1,0 0,88
E0 50 µl Eau distillée + 1 ml réactif 0,0 0,03
CT 50 µl CQI + 1 ml réactif 0,98 0,84
P1 50 µl P1 + 1 ml réactif 0,68 0,78
P2 50 µl P2 + 1 ml réactif 1,24 1,46


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- 3.3. Autres caractéristiques d’un dosage biochimique photométrique


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  • 3.3.1 Domaine de mesure

Si l’on se rapporte au § 3. Représentation graphique de cette relation, il est important de définir pour ce dosage le domaine de mesure, c’est-à-dire la limite de quantification, d’une part, et la limite de linéarité, d’autre part.

  1. Limite de quantification
    La limite de quantification correspond à la valeur la plus basse en dessous de laquelle les résultats ne sont plus fiables, notamment car non répétables.
    La détermination de cette limite fait appel à des mesures expérimentales dont nous ne donnerons pas le détail ici. Il faut simplement savoir que cette limite est indiquée dans la notice des kits commerciaux de réactif. Elle peut être égale à zéro ou, fréquemment, supérieure à zéro. En dessous de cette valeur (si elle est non nulle) on ne peut pas mesurer précisément une concentration. Le résultat sera alors rendu comme « inférieur à la limite de quantification ». Il n’y a pas de solution pour rendre un résultat s’il est inférieur à la limite de détection, à moins de changer de méthode de dosage (ou de la modifier). De plus, l’intérêt médical de rendre une valeur inférieure à la limite de quantification est généralement faible.
    Exemple :
    Le fournisseur du kit de glucose oxydase utilisé indique que la limite de quantification est égale à, 0,1 g/l. Si la valeur mesurée correspond à 0,07 g/l, le résultat rendu ne sera pas « =0,07 g/l » mais « <0,1 g/l ».
  2. Limite de linéarité
    La limite de linéarité est la valeur de concentration au delà de laquelle la relation entre la DO et la concentration n’est plus linéaire, c’est-à-dire que la loi de Beer Lambert n’est plus respectée à cause d’une trop forte concentration de la molécule à doser.
    En général, on fait en sorte que la droite d’étalonnage comporte un point proche de la limite de linéarité. La limite de linéarité est également indiquée par le fournisseur dans la notice des kits commerciaux de dosage. Sinon, on peut considérer que le point le plus élevé de la droite d’étalonnage correspond à la limite de linéarité.
    Si la concentration mesurée est supérieure à la limite de linéarité, on dilue l’échantillon de façon à ce que la concentration de la substance à doser soit comprise entre la limite de quantification et la limite de linéarité. En général, on peut diluer dans l’eau distillée ou le sérum physiologique (NaCl 9°/00) qui présente l’intérêt d’être plus proche du sérum que l’eau pure. La notice d’utilisation des kits commerciaux indique la nature du solvant à utiliser pour les dilutions si ce n’est pas de l’eau.

Exemple :
Le fournisseur du kit de glucose oxydase utilisé indique que la limite de linéarité est égale à 2,0 g/l. La valeur mesurée pour le sérum d’un patient correspond à 2,4 g/l, résultat qui ne pourra être rendu tel quel. On effectue une dilution au ½ (200 µl sérum + 200 µl eau) dans un tube et on effectue la réaction sur cette dilution. On obtient une concentration de 1,35 g/l. On multiplie ce résultat par 2 (facteur de dilution) et on obtient de concentration de 2,70 g/l.
Le résultat pour ce patient est 2,70 g/l.


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  • 3.3.2. Le CQI comme contrôle de l’étalonnage

Dans le cas d’une méthode de dosage manuelle, il est en général nécessaire d’étalonner (de réaliser une gamme d’étalonnage) à chaque série et, quelques soient les précautions prises par l’opérateur, la droite d’étalonnage ne sera jamais exactement la même.
Cf. figure ci-dessous :
un jour, ce sera la droite rouge, le lendemain la droite bleue, un autre jour, la droite verte, etc.

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Figure 9 : Variabilité de la droite d’étalonnage : étalonnages acceptables

Plusieurs facteurs peuvent expliquer cette variabilité :

  1. L’étalon :
    - L’étalon peut « vieillir », s’il est utilisé et réutilisé pendant plusieurs jours.
    - Parfois l’étalon doit être reconstitué par l’opérateur avec de l’eau distillée ou un autre solvant : dans ce cas, il est essentiel qu’il soit reconstitué de la façon la plus précise possible (pipettes de très bonne qualité, précises et justes) avec l’eau également de la meilleure qualité possible. Cette étape de reconstitution est toujours source de variabilité.
  2. Le réactif :
    - lui aussi est utilisé dans plusieurs séries, donc il « vieillit » ; il faut donc veiller à ce que les conditions de conservation des réactifs, comme des étalons, soient les meilleures possibles ;
    - le réactif est parfois préparé par l’utilisateur (en mélangeant un réactif avec un tampon, par exemple) ; cela induit également une variabilité.
  3. L’appareil de mesure
    - Les performances de l’appareil de mesure (spectrophotomètre ou photomètre) peuvent également varier : usure de la lampe, empoussièrement…

Tous ces facteurs sont autant de variables qui vont influencer l’allure de la courbe d’étalonnage ainsi que chaque mesure.
Au-delà de certaines limites, les droites d’étalonnage ne sont plus acceptables (droites en pointillé ci-dessous).

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Figure 10 : Variabilité de la droite d’étalonnage :étalonnages inacceptables

C’est le CQI qui permet de dire si les conditions de réaction et de mesure sont acceptables et si les résultats donnés par la méthode seront fiables.

Note :
Certaines réactions biochimiques ne font pas appel à un étalonnage. Il s’agit notamment de la mesure de l’activité des enzymes telles que, transaminases, lactate deshydrgénase, phosphatases alcalines, etc.
Dans ce cas, la concentration est déduite de la DO par la loi de Beer Lambert en connaissant le coefficient d’extinction molaire ε (coefficient indiqué dans la notice des kits commerciaux). Le contrôle du bon fonctionnement de la réaction repose uniquement sur l’analyse du CQI.


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  • 3.3.3. Contrôles de qualité interne et contrôle de qualité externe

- 1. Le contrôle de qualité interne (CQI)
Le CQI permet d’évaluer la précision d’une méthode. Sa valeur est connue par le technicien. Il doit être testé aussi souvent que nécessaire (fréquence à déterminer par chaque laboratoire) :
- à chaque série,
- au moins après chaque étalonnage
- en cas de doute

Son résultat étant connu immédiatement, il permet une correction préventive (réétalonnage, maintenance, changement de réactif…) ; il permet également de mesurer la reproductibilité, c’est-à-dire la capacité de la méthode de dosage à rendre un résultat comparable d’une série à l’autre ou d’un jour à l’autre.
NDLA : Se rapporter à une fiche consacrée au contrôle de qualité

- 2. Le contrôle de qualité externe
Le CQ externe : contrôle d’exactitude dont la valeur n’est pas connue du technicien et qui est testé ponctuellement. Le résultat rendu par le laboratoire est comparé aux résultats rendus par d’autres laboratoires, éventuellement par des laboratoires de référence (les « groupes de pairs »). Le CQ externe est en général organisé par une autorité régionale, nationale ou internationale.


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  • 3.3.4. Les réactifs

A l’intérieur du terme « Réactif », on peut inclure le réactif au sens propre du terme (acide picrique, glucose oxydase, anticorps…) et un tampon qui permet un environnement optimal de la réaction chimique enzymatique ou de la réaction Antigène-Anticorps. Pour un même dosage, on peut avoir une technique en mono-réactif, un seul réactif comprend tous les éléments nécessaires à la réaction, ou en bi-réactif, la réaction se déroule après ajout successif de 2 réactifs.


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  • 3.3.5. Blanc réactif et blanc échantillon

Blanc réactif : DO obtenue en photométrant le réactif seul ou mélangé avec de l’eau ou du sérum physiologique. On utilise généralement cette DO pour régler l’absorbance sur 0 (zéro de l’appareil). Le blanc réactif sert à éliminer le signal dû au réactif seul et à l’appareil

Blanc-échantillon : DO obtenue en photométrant
- Soit le mélange réactif + échantillon avant que la réaction ait eu le temps de se développer
- Soit le mélange réactionnel avant qu’on ajoute le réactif déclenchant.
Il sert à éliminer le signal dû à l’échantillon (s’il est trouble par exemple).


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  • 3.3.6. Mesure en point final ou en cinétique

Détermination en point final :
On attend la fin de la réaction, le « plateau », pour faire la mesure de DO.
Plus la concentration est importante, plus la DO est élevée.

Détermination en cinétique :
On effectue plusieurs mesures dans la phase de croissance de la DO. On détermine une pente ou Δ DO.
Plus la concentration est importante, plus la pente est élevée.

Les activités enzymatiques (transaminases, phosphatases alcalines,…) sont généralement mesurées en cinétique.
Les substrats comme la créatinine peuvent être mesurées par les 2 méthodes.
- En technique manuelle, la méthode en point final donne de bons résultats
- En technique automatisée, la méthode en cinétique permet de résoudre certains problèmes d’interférence et permet de diminuer le temps d’analyse


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  • 3.3.7. Interférences

Erreur (inexactitude) entraînée par la présence dans l’échantillon d’une substance qui gène la réaction (médicament) ou qui absorbe le rayonnement incident à la même longueur d’onde que le produit de la réaction (lactescence et hémoglobine ; hémolyse et dosage Trinder). Les principales interférences doivent être connues et sont indiquées dans les notices des kits commerciaux.


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