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29 avril 2015
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Etapes pré-analytiques

Prélèvement de sang capillaire ou de sang veineux sur tube EDTA (même tube que l’hémogramme).

Méthode d’analyse

Principe et intérêt

Permet de classer les anémies en régénératives et arégénératives.

Le taux d’érythrocytes (ou hématies) par mm3 ou par litre doit être connu pour les calculs des valeurs rapportées au volume de sang (voir cellule de Thoma ou cellule de Malassez).

Les réticulocytes sont des hématies jeunes contenant encore quelques granules ou filaments d’ARN. La coloration au bleu de crésyl fait apparaître ces éléments colorés en bleu foncé.

Les réticulocytes ne se colorent que "vivants" ; il faut donc procéder à la coloration avant la confection du frottis (donc en tube à hémolyse) ; les réticulocytes sont dénombrés sur frottis parallèlement aux hématies.

Matériel et réactif

- Tubes à hémolyse.
- Bain-marie ou étuve.
- Lames et pipettes.
- Bleu de crésyl brillant.

Mode opératoire

- Introduire dans un petit tube 6 - 8 gouttes de sang et 6 - 8 gouttes de réactif (cf. infra) ; mélanger en roulant le tube entre les deux mains et boucher le tube avec du coton (ou du papier).
- Mettre à une température proche de 37 ° pendant 10 à 20 minutes, sans surchauffer.
- Préparer des frottis très minces [1], laisser sécher. Ne pas contre colorer.

Numération et résultats

Choisir, à l’objectif x 10, une zone dans laquelle les hématies sont bien étalés, ne se chevauchent pas et ou leur densité est homogène (cette zone est en général située vers la queue du frottis).

Effectuer ensuite la numération à l’objectif x 100.

Les hématies sont uniformément colorées en bleu-vert pâle. Les réticulocytes apparaissent comme des hématies avec des grains ou filaments bleu violacé.
ATTENTION de ne pas confondre ces grains ou filaments d’ARN avec des taches de colorants.

- 1 Comptage et résultats en pourcentage de réticulocytes par rapport aux hématies.

  • se placer dans une zone où les hématies sont bien séparées les unes des autres (en queue de frottis), repérable par examen à l’objectif x10,
  • déposer une goutte d’huile à immersion puis passe à l’objectif x100,
  • compter les hématies les unes après les autres (500 par exemple) en notant chaque réticulocyte rencontré au cours de ce décompte

Le % de réticulocytes est : % Ret = (R / H) x 10
où R = nombre de réticulocytes et H = nombre d’hématies.

- 2 Le résultat doit être exprimé en nombre absolu (ou valeur absolue) c’est à dire le nombre de réticulocytes par mm3 (= µl) ou par litre de sang.

On obtient ce résultat en multipliant le pourcentage obtenu, exprimé de façon décimale (ex : 8% = 0,08 ; 15 % = 0,15) par le nombre total d’hématies par mm3 ou par litre, déterminé par ailleurs.

Exemple de calcul de la valeur absolue des réticulocytes : on a trouvé 5 réticulocytes pour 100 érythrocytes (hématies) et la numération des hématies est de 3 500 000 par mm3 : la valeur absolue des réticulocytes est de 5 X 3 500 000 / 100 = 175 000 réticulocytes/mm3.

Réalisation à partir de sang capillaire

On met, à la pipette, 3 ou 4 gouttes de bleu de crésyl brillant dans un tube à hémolyse puis on fait tomber 3 ou 4 gouttes de sang capillaire dans le tube
Comme le colorant contient du citrate de Na, le sang ne coagule pas

On homogénéise de la même façon puis on procède de la même façon que ci-dessus.

Valeurs normales

- En valeurs relatives : 0,5 à 2 % des hématies
- En valeur absolue : 25 000 à 75 000 / mm 3 ou 25 à 75 giga / litre
Une anémie est considérée comme régénérative si le taux de réticulocytes est supérieur à 120 000 / mm3 ou 120 giga / l et comme non régénérative si le taux est supérieur à 90 000 / mm3 ou 90 giga / l.

Préparation des réactifs

- Mélanger 1 gramme de bleu de crésyl brillant dans 100 ml de serum physiologique (eau distillée additionnée de 9 grammes de Nacl par litre d’eau).
- Si la dissolution est difficile, chauffer légèrement.
- Après dissolution, rajouter 0.4 gramme de citrate de sodium (anticoagulant indispensable pour l’étude sur sang capillaire).
- Agiter et filtrer.
La solution se conserve plusieurs mois au réfrigérateur, il suffit juste de la filtrer si un dépôt se forme.
On peut à la rigueur remplacer le bleu de crésyl par 1 gramme de bleu de méthylène pur.


notes

[1le frottis se doit d’être très fin, l’objectif étant de trouver des zones dans les quelles les hématies sont dispersées en couche monocellulaire et non pas entassées les unes sur les autres, ce qui rendrait impossible le comptage du nombre de réticulocytes par rapport au nombre d’hématies.

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