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>>Coloration de Gram

10 janvier 2011
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Niveau de mise à jour : 4

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C’est "LA" coloration en bactériologie : la plus utilisée, avec celle de Ziehl pour les mycobactéries.

Elle permet de différentier les bactéries dites :
- Gram positives ou "plus", apparaissant en violet,
- de celles dites Gram négatives ou "moins", apparaissant en rouge (avec la fuchsine) ou rouge orangé (avec la safranine).

Matériel :

Lames propres et bien dégraissées,
Porte lames

Colorants et réactifs

Pour la préparation des colorants voir. Autrement nous conseillons les excellents colorants commercialisés par RAL) :

- Violet de gentiane,
- Solution iodée de Gram = lugol,
- Solution de safranine, de préférence (safranine O :25 g ; éthanol à 95 °GL : 100 ml ; solution aqueuse d’oxalate d’ammonium à 25 g/l : 800 ml) ou, éventuellement, de fuchsine pour Gram (fuchsine de Ziehl = fuchsine basique : 10 g ; phénol : 50 g ; éthanol : 100 ml ; eau distillée : 1 l. Diluer au 1/10° pour la fuchsine pour Gram. Cette solution ne se conserve que quelques jours.),
- Décolorant : alcool acétone ou alcool à 90°.

Mode opératoire :

- Préparation de la lame :

  • réalisez un frottis ou un étalement du prélèvement ou de la culture à examiner,
  • laissez sécher complètement la préparation,
  • fixez la à la flamme en la chauffant à environ 70° C (supportable pour un passage rapide sur le dos de la main) ou en la recouvrant d’alcool à 90° pendant 5 min et en la laissant sécher,

- laissez refroidir la lame et la déposer sur un porte lame.

- Coloration :

  • recouvrez le frottis (ou immerger la lame) avec la solution de cristal violet ou violet de gentiane pendant environ 1minute,
  • égouttez bien la lame et/ou rincez la délicatement à l’eau et bien l’égoutter,
  • recouvrez le frottis (ou immergez la lame) avec du lugol (la bétadine dermique est utilisable) environ 20 secondes trois fois de suite (ou immergez la lame environ 60 secondes en agitant légèrement),
  • rincez la délicatement à nouveau à l’eau et égouttez la bien,
  • décolorez exactement 10 secondes avec de l’alcool – acétone (20 à 30 secondes avec l’alcool à 90° sans acétone) en faisant couler goutte à goutte le réactif sur la lame inclinée (faites la osciller tout ce temps pour bien balayer toute la surface) ou en immergeant les lames pendant dix secondes dans l’alcool – acétone ou 20 à 30 secondes dans l’alcool seule (à 90°), en les agitant en permanence (faire quelques essais pour trouver le temps idéal dans les conditions locales de température, surtout avec l’alcool seule),
  • lavez immédiatement à l’eau pour arrêter la décoloration et bien l’égoutter,
  • recouvrez le frottis (ou immergez la lame), pour la recolorer, avec la solution de safranine (ou de fuchsine de Ziehl diluée au 1/10°) pendant 20 à 30 secondes,
  • lavez à l’eau, égouttez bien, et séchez à l’air, éventuellement en chauffant à 50/60° C. La lame doit être parfaitement sèche avant de mettre dessus l’huile à immersion.
  • observez à l’objectif x100, en immersion avec l’huile à immersion.

La technique par trempage ou immersion des lames se fait en utilisant de petits cristallisoirs et des portes lames en verre ou en métal ou des boites rainurées pour coloration. Elle permet de gagner du temps, d’économiser des colorants et évite les dépôts de précipités qui restent au fond du cristallisoir mais

Attention :
- la coloration par immersion ne doit pas être utilisée pour des prélèvements ou le fait de voir un seul germe est significatif (exemple : liquide céphalorachidien) car il y a risque de contaminations de lame à lame (de même, elle sera exclue, pour la même raison, dans les recherches de mycobactéries par la technique de coloration de Ziehl),
- les colorants et le décolorant doivent être changés après coloration d’environ 50 à 100 lames (dilution et contamination des colorants par les précédentes lames) et, dans tous les cas, ils sont jetés en fin de journée ou si les colorations deviennent de mauvaise qualité.

Résultat :

Les bactéries Gram + sont colorées en violet, les bactéries Gram - sont colorées en rose orangé (safranine) ou rose (fuchsine), ceci étant dû à une différence de composition de la paroi entre Gram + et Gram -.

Risques d’erreurs :

Attention, une mauvaise coloration peut conduire à des erreurs d’identification bactérienne ou à une mauvaise orientation de diagnostic.

- Faux Gram (+) :

  • étalement trop épais (mauvaise décoloration des bactéries en profondeur),
  • dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour y remédier,
  • solution iodée mal égouttée,
  • décolorant laissé trop peu de temps,
  • utilisation de la fuchsine avec certains germes : les Neisseria et les Acinetobacter, en particulier, sont "avides" en fuchsine et la concentrent jusqu’à un rouge sombre difficile à distinguer du violet.

- Faux Gram (-) :

  • dans toute population de Gram + on voit des Gram - (parfois très nombreux) : ce sont des cadavres de bactéries Gram +,
  • colorants de mauvaise qualité ou trop dilués,
  • solution de lugol laissée trop peu de temps,
  • décolorant laissé trop longtemps ou mal rincé.

Contrôle de qualité :

Etalez une mince couche de selles sur une lame et colorez là. Il doit apparaître de nombreuses bactéries Gram positif et négatif.

Remarque : Il est recommandé de réaliser, avec la même préparation de selles diluées, une ou plusieurs dizaines de lames que l’on sèche, que l’on fixe et qu’on emballe séparément avec du papier aluminium . On les conserve à +4°C. Cela permet d’éliminer le paramètre : épaisseur du frottis et de se concentrer sur la qualité des réactifs et sur les temps de coloration et de décoloration.


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