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>>Coloration de Ziehl-Neelsen, à chaud

10 janvier 2011
Auteur(s) : 

Niveau de mise à jour : 4

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Relecture / Mise sous Spip : 21/07/07. Y. Gille.

Voir aussi : Coloration de Ziehl-Armand

But :

Coloration pour la mise en évidence des "[*Bacilles Acido-Alcoolo Résistants*]" (BAAR) ou mycobactéries : Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium ulcerans et tout autre mycobactérie.
Cette coloration permet également de mettre en évidence des bactéries comme Nocardia (faible coloration au Ziehl) ou des micro-organismes comme Cyclospora cayetanensis

Matériel :

lames neuves si possible, coton, pince en métal, porte lames, masque et lunettes.

Réactifs et colorants :

- alcool 95 °,
- acide sulfurique dilué au ¼ avec de l’eau,
- fuchsine phéniquée de Ziehl,
- bleu de méthylène phéniqué.

Attention à filtrer les colorants au moindre doute de précipité.

Si on ne dispose pas de solutions prêtes à l’emploi voir en bas de la fiche leur préparation.

Préalable :

Afin d’éviter toute contamination, il est impératif d’observer toutes les règles d’hygiène et de sécurité en vigueur.

Procédez à un prélèvement de crachat puis étalez le sur lame. Attention à bien suivre ce protocole d’étalement en utilisant l’écrasement entre 2 lames (pression progressive et douce pour qu’il n’y ait pas de projections) pour réaliser 2 étalements.

Fixez la lame par la chaleur en la posant 5 minutes sur une platine chauffante à environ 60-70° (on ne peut y laisser la main plus d’une serconde) ou passez la dans la flamme du bec Bunsen jusqu’à ce qu’elle ne puiise être posée plus d’une seconde sur la main.

Filtrez les colorants, s’ils ne sont pas limpides ainsi que l’eau de dilution.

Mode opératoire :

- *posez la lame sur son support, recouvrez l’étalement de fuchsine phéniquée de Ziehl (concentrée, donc pas celle de Gram qui est de la fuchsine de Ziehl diluée !),
- *prenez un coton imbibé d’alcool avec la pince en métal, l’enflammez et chauffez la lame par le dessous jusqu’à émission de vapeurs par le colorant mais sans aller jusqu’à l’ébullition ; vous pouvez aussi chauffer délicatement sur la flamme du bec ou sur une platine chauffante,
- *recommencez encore deux fois l’opération , le tout en une dizaine de minutes. Remettez de la fuchsine pour éviter que la lame ne sèche même en partie : la lame doit rester impérativement couverte de colorant,
- *éliminez tout le colorant par lavage à l’eau,
- *recouvrez d’acide sulfurique dilué au quart dans l’eau pendant 2 min, l’étalement devient jaunâtre,
- *lavez soigneusement à l’eau,
- *recouvrez d’alcool à 95 ° pendant 3 min, l’étalement devient rose pale,
- *lavez soigneusement à l’eau,
- *recouvrez de bleu de méthylène phéniqué pendant 30 secondes à 1 mn,
- *lavez soigneusement à l’eau, essuyez la face inférieure et laissez sécher l’étalement à l’air ou sur une platine chauffante.

Résultat :

Observez à l’objectif X100.
Les BAAR apparaissent en rouge sur un fond bleu. Ils peuvent avoir différentes morphologies : de bâtonnets assez larges et trapus à de très fins fils rouges à la limite de la visibilité.
- Les bacilles de Koch (Mycobacterium tuberculosis) sont souvent d’aspect granuleux et parfois regroupés en faisceaux ou en cordes, souvent flexueux pour les formes longues.
- Les bacilles de Hansen (M. leprae) sont souvent groupés en globis (paquets en forme de ballon de rugby, de boule, de nombreux bacilles rouges).
Soit vous voyez au moins 2 mycobactéries. Vous répondrez : "présence de mycobactéries" (ou de "bacilles acido-alcoolo-résistants). On peut préciser une réponse semi-quantitative : s’il n’y a que de rares bacilles sur toute la lame : "rares bacilles". S’il y en a dans plus de la moitié des champs : "assez nombreux bacilles". S’il y en a plusieurs par champ : "nombreux bacilles". Si ils sont très nombreux (plus de 10 ou 20) dans chaque champ : "très nombreux bacilles".
Soit on n’en voit pas : il faut examiner toute la surface de la lame (environ 30 mn : Tison et Carbonel) avant de pouvoir répondre "absence de Mycobactéries à l’examen microscopique".

Contrôle de qualité :

Il existe un moyen très simple de vérifier la qualité de votre coloration : étalez une petite goutte de BCG (même périmé !) sur une lame, fixez, colorez au Ziehl et examinez cet étalement coloré. Vous devez voir de petits bacilles rouge vif et de nombreux bacilles à peine colorés qui sont probablement des cadavres de BCG.
Vous pouvez aussi mélanger très énergiquement à votre propre crachat très peu de BCG (une très petite goutte dans un gros crachat), puis l’étaler comme les crachats à tester et colorer en même temps que vos lames. La lame contenant le BCG est remplie de petits bacilles rouges, acido-alcoolo-résistants.

Variante appliquée à la recherche de M. leprae ou bacille de Hansen (BH) :

M. leprae se décolore plus facilement que le BK et apparentés, on laissera donc la lame en contact de l’acide sulfurique pendant seulement 1 minute et de l’alcool pendant seulement 45 secondes.

Préparation des réactifs :

FUCHSINE PHÉNIQUÉE : à tenir à l’abri de la lumière et à filtrer avant usage.

ATTENTION : la manipulation du phénol cristallisé nécessite le port de gant et de lunettes de protection, le produit étant corrosif.

Dans 1 mortier broyer et mélanger :
- fuchsine basique : 5 grammes
- phénol cristallisé : 25 grammes
- alcool éthylique 95° : 50 ml

Quand le mélange est bien homogène, le verser dans un récipient de 500 à 1000 ml.
Rincer le mortier avec 100 ml d’eau distillée chaude puis transférer dans le récipient.

Laisser reposer à température ambiante pendant 24 heures.
Ajouter 400 ml d’eau distillée

BLEU DE MÉTHYLÈNE : à tenir à l’abri de la lumière et à filtrer avant usage.
- H2O distillée : 2 000 ml
- bleu de méthylène médicinal : 40 g
- 40 grammes de phénol cristallisé
- alcool à 95 ° : 200 ml

ACIDE :
- H2O distillée : 1 500 ml
- Acide sulfurique : 500 ml
soit environ 2,5 N.
ATTENTION à bien mettre l’acide dans l’eau (progressivement) et non l’inverse !

Remarque : à défaut d’acide sulfurique, on peut utiliser de l’acide nitrique ou de l’acide chlorhydrique.

ALCOOL :
- alcool à 95° (mieux à 100° : éthanol absolu).


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