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>>Diagnostic du choléra

6 janvier 2015
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Niveau de mise à jour : 5

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Mise sous Spip : 08/01/2011.

Généralités :

Diarrhée infectieuse due à la toxine de Vibrio cholerae sérotype O1 ou O139.

Détecter les premiers cas de choléra dans une population (où il n’est pas endémique) permettra de mettre immédiatement en place des mesures prophylactiques simples mais très efficaces (basées sur une large utilisation de l’eau de Javel) qui pourront parfaitement bloquer une épidémie.
Il est donc essentiel que n’importe quel laboratoire de 1° niveau soit en mesure d’effectuer un diagnostic de forte suspicion, au moins sur les cas typiques (diarrhée profuse et "eau de riz").

- Le diagnostique de suspicion de Vibrio cholerae dans les selles peut être fait au niveau d’un laboratoire de 1° niveau dans la forme typique de choléra.
- Avec quelques compléments ce laboratoire pourra réaliser un enrichissement pour les formes moins typiques.
- Le diagnostic complet : culture, identification, sérotypie... relève d’un laboratoire équipé pour la bactériologie.

Forme typique :

Les selles sont très abondantes (5 litres et jusqu’à 10 à 20 l par jour), totalement liquides et non fécales, c’est un liquide blanchâtre (dit "eau de riz").

Prenez une goutte de ces selles et :
- l’examiner entre lame et lamelle : dans un choléra typique, elle apparait très riche en bacilles doués d’une formidable mobilité (bien plus rapide que des Pseudomonas). Parfois ces bacilles se déplacent dans la même direction et changent tous ensemble de direction (mouvement "en vol de perdreaux") ce qui est très en faveur du diagnostic de V. cholerae.
- faites glisser la lamelle dans le pot de Javel avec un fétu de bois, séchez, fixez et colorez au Gram : dans un choléra typique vous verrez de très nombreux bacilles Gram négatifs, généralement en virgule ou arc de cercle. Ils sont assez courts (un peu plus long qu’une entérobactérie), assez fins, souvent rose clair. Il n’y a pas ou très peu d’autres bactéries.

Forme peu typique :

- La diarrhée est moyennement ou peu abondante, les selles peuvent être fécales.
- L’examen microscopique direct entre lame et lamelle puis après coloration de Gram n’est pas parlant ou incertain.
- Il va donc falloir pratiquer un enrichissement.

Recherche de portage :

- Il n’y a pas ou très peu de signes cliniques.
- L’examen microscopique direct n’a pas d’intérêt : ne pas l’effectuer.
- Il va falloir impérativement pratiquer un enrichissement.

Enrichissement :

1) Matériel :
- étuve (voir "étuve de fortune") ou bain marie,
- consommable : pipettes Pasteur, lames et lamelles, tubes contenant environ 10 ml d’eau peptonée alcaline hyper-salée.

L’eau peptonée alcaline hyper-salée est de l’eau peptonée ordinaire mais contenant au moins 30 g/l et de préférence 100g/l (10%) de chlorure de sodium (sel) et dont le pH est alcalinisé jusqu’à 8,6 [1] [2].

- On peut facilement en réaliser à partir de tubes d’eau peptonée qu’on enrichi en sel (environ 0,9 g pour un tube de 10 ml, l’eau peptonée contenant déjà 5 g/l de NaCl) puis qu’on alcalinise à la soude (le contrôle au papier pH est suffisant, en s’arrêtant à pH 8). On les place ensuite 10 mn dans un bain marie bouillant. Cette décontamination est suffisante car ce milieu est très hostile pour de très nombreuses bactéries et ne permet pas la reviviscence des spores.
- On peut aussi bien partir de poudre pour eau peptonée que l’on salera et alcalinisera.

2) Réalisation :
- mettre environ 1 ml ou un petit pois de selles dans un tube d’eau peptonée alcaline hyper-salée. Ecraser grossièrement les selles et agiter légèrement. Ne bloquez pas le bouchon du tube (V. cholerae aime l’oxygène) ;
- incuber, verticalement, 6 à 8 h entre 30 et 36° C au bain marie ou à l’étuve. Ne pas agiter le tube ;
- prendre à la surface de l’eau peptonée [3] de ce 1° tube incubé une goutte de liquide et l’examiner entre lame et lamelle puis au Gram, à la recherche de Vibrio (aspect des selles typiques vues ci-dessus),
- si on ne voit pas de vibrions dans ce premier tube incubé, prendre à la surface de l’eau peptonée une effilure de pipette Pasteur de liquide et la transférer dans un nouveau tube du même milieu. Incuber ce nouveau tube comme précédemment ;
- renouveler la même manipulation 6 à 8 h plus tard à partir du deuxième tube. C’est à dire : examiner le liquide et ensemencer un nouveau (3°) tube si l’examen microscopique est négatif ou douteux,
- après incubation du 3° tube : examiner le bouillon.

3) Résultats :
- A) des vibrions typiques (mobilité, forme) tels que décrit ci-dessus dans les selles sont visibles dans le 1° ou le 2° ou le 3° tube : il y a une très forte suspicion de maladie ou de portage de V. cholerae : prendre les mesures prophylactiques contre le choléra (utilisation large de l’eau de Javel pour tout ce qui a pu être contaminé par le bacille, traitement des selles à la Javel),
- B) on ne voit pas de vibrions dans aucune des cultures : le diagnostic de maladie ou de portage de V. cholerae est exclu.

Culture sur milieu solide :

Même si la culture sur gélose est habituellement exclue du laboratoire de 1° niveau, on peut ici l’envisager car :
- la gélose utilisée (TCBS) est si inhibitrice qu’elle ne nécessite pas d’autres stérilisation que 10 minutes d’ébullition,
- très peu de bactéries autres que des vibrions cultivent sur cette gélose : la présence de bactéries est presque synonyme de vibrions qu’on confirmera seulement microscopiquement. Le seul risque est qu’on soit en présence de Vibrio d’une autre espèce que V. cholerae.
- V. cholerae est peu exigeant quant à sa température de culture : entre 30 et 36° C (et probablement jusqu’à 25° C mais moins rapidement).


notes

[1L’eau peptonée seulement hyper-salée donne presque d’aussi bons résultats. Beaucoup d’auteurs conseillent de l’eau peptonée seulement alcaline. Cependant il est dommage de ne pas profiter à la fois du caractère halophile ET de la résistance au pH alcalin de V. cholerae pour enrichir une selle. Cf. Précis de bactériologie clinique, J. Freney et al, Ed. ESKA.

[3puisque V. cholerae aime l’oxygène, donc la surface du bouillon.

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