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16 décembre 2011
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GENERALITES

Au cours des bactériémies ou même des septicémies, les bactéries sont, dans l’immense majorité des cas, beaucoup trop rares dans le sang pour pouvoir être visualisées au microscope [1]. Il y aura donc toujours une étape de mise en culture du sang et ce sont ces cultures qui seront examinées.

PRELEVEMENT

Moment du prélèvement

On prélèvera impérativement au moment d’un frisson ou, au moins, au moment où le patient dit avoir froid, car c’est le moment où la fièvre monte, donc où les bactéries circulent. A l’inverse on ne fera jamais de prélèvements lorsque la température baisse c’est à dire, cliniquement, lorsque le patient dit avoir trop chaud ou transpire. Si il n’y a jamais de frissons ou de sensation de froid, on pratiquera les hémocultures plutôt entre 17 et 19 h.
On s’efforcera toujours de faire le prélèvement avant toute administration d’antibiotiques. Si ce n’est pas le cas on tentera d’effectuer une fenêtre thérapeutique d’au moins 24 h ou 48 h avant d’effectuer les prélèvements.
Pratiquement dans tous les cas les hémocultures sont beaucoup plus fréquemment positives en début de maladie qu’ultérieurement (les défenses organiques se sont installées).

Nombre de prélèvements. Quantité de sang prélevé

La quantité de sang mise dans les flacons d’hémoculture doit être d’environ 10 % du volume du bouillon de culture. Cela signifie que pour un flacon contenant 100 ml de bouillon on mettra 10 ml de sang. Pour des flacon contenant 70 ml on mettra 7 ml de sang et si on a fabriqué soit même des flacons contenant 300 ml on mettra 30 ml de bouillon.
On considère que la quantité nécessaire et suffisante en une journée est de 6 flacon (de 70 ou 100 ml) prélevés part lots de 2 (1 aérobie, 1 anaérobie) à 10 ou 30 mn d’interval. Mais il a été démontré que prélever en une fois (pourvue que ce soit au bon moment (cf. ci-dessus), lorsque la fièvre monte) 60 ml de sang et le répartir entre 6 flacons (ou tout mettre dans deux flacons contenant chacun 300 ml de bouillon) donne les mêmes résultats... ceci en piquant moins souvent le patient et en donnant moins de travail à l’infirmier ! On préfèrera donc cette technique, d’autant que le moment idéal ne dure pas toujours bien longtemps.
En principe une hémoculture comprend une mise en culture en aérobiose et une mise en culture en anaérobiose. On dispose donc, généralement, d’un flacon dit aérobie et d’un flacon dit anaérobie.
En pratique si on ne dispose que d’un seul type de flacon (de préférence anaérobie) cela n’a pas une grosse importance.

Comment prélever

On prélève par ponction à l’aiguille métallique montée sur seringue une veine périphérique. L’asepsie doit être très soigneuse (voir : Antisepsie de la peau). La fréquence d’isolement dans des hémocultures prélevées négligemment de Staphylococcus epidermidis (principal germe de la flore cutanée aérobie) alors qu’il n’est que rarement responsable d’infections, montre combien les contaminations d’origine cutané sont courantes.
Nous rappellerons que les antiseptiques nécessitent un délai d’action d’au moins 5 minutes. Nous conseillons d’utilisé, après toilette locale, un antiseptique iodé (Bétadine ®) ou de la chlorhexidine. L’asepsie est commencée avant tout autre geste. Le tampon imprégné d’antiseptique est laissé en place au point que l’on envisage de ponctionner. On préparera alors sa seringue de ponction, ses flacons dont on aseptisera les bouchons, on placera le garrot, etc… Juste au moment de piquer, on passe alors un nouveau tampon imprégné de Bétadine puis on effectue la ponction.

INCUBATION

Elle sera faite, très banalement, à 36°, pendant 24 h (voir étuve de fortune).
Pour la plupart des bactéries la température d’incubation n’est pas critique mais toujours se rappeler qu’il vaut mieux une température trop basse (elle ralentie seulement la pousse) qu’une trop haute (elle tue les bactéries !).
En cas d’absence de pousse on poursuivra l’incubation une semaine en examinant le bouillon matin et soir.

EXAMEN et TRAITEMENT DES FLACONS

Après 18 à 24 h d’incubation on regardera :
- si l liquide est trouble (attention de ne pas agiter les flacons !),
- s’il est clair : s’il n’y a pas des grains suspects sur le tapis de globules,
- s’il est clair et sans grains : s’il n’y a pas un trouble à peine visible en surface du liquide,
ces trois éléments étant des signes de pousse bactérienne.

Si il y a des signes de pousse bactérienne, on ouvrira le flacon [2] et on prélèvera à la pipette Pasteur :
- environ 1 ml du bouillon si il est homogènement trouble,
- ou plusieurs grains suspects s’il y en a,
- ou la surface du bouillon si le trouble est limité à cette seule surface.

On déposera un petite goutte sur une lame et le reste du bouillon dans un tube à centrifuger. On recouvrera immédiatement d’une lamelle.

L’examen entre lame et lamelle montrera s’il y a ou non des bactéries.

Si oui, on versera environ 5 ml de sérum physiologique stérile (ou à la rigueur d’eau filtrée) dans le tube à centrifuger, on mélangera, on centrifugera environ 5 mn à 3-5000 tours (avec une centrifugeuse de paillasse courante), on éliminera le surnageant et on étalera une partit de culot sur une lame qu’on colorera au Gram [3].

INTERPRETATION DES RESULTATS

1) Les hémocultures négatives n’éliminent rien ! Si elles restent négatives, cela démontre seulement que l’on n’a pas mis en évidence de germes, non qu’ils n’y étaient pas !

2) L’interprétation se fera sur l’aspect des germes (forme et Gram, éventuellement mobilité vue entre lame et lamelle), rapproché des renseignements cliniques et biologiques.

3) Une des principales difficultés d’interprétation est de distinguer les contaminations des véritables bactériémies ou septicémies. On s’appuiera pour cette distinction au moins sur trois éléments :
- la nature des germes identifiés : les bactéries de la peau sont évidemment beaucoup plus souvent contaminantes que des bactéries exceptionnellement présentent sur la peau. Donc trouver une bactérie fréquente sur la peau (staphylocoque non doré, corynébactérie...) est très suspect d’une contamination ;
- le nombre de flacons positifs avec une espèce bactérienne : plus ce nombre est important plus la probabilité d’infection avec cette espèce augmente.
- du mono ou pluri-microbisme : septicémies et bactériémies sont très habituellement mono-microbiennes (hormis les cholécystites, elles presque toujours responsables de bactériémies pluri-microbiennes). La présence de plusieurs espèces bactériennes est donc souvent en faveur d’une souillure du prélèvement (mais peut-être qu’un des germes est bien significatif !).
Il est donc très important de faire très soigneusement l’aseptise ce qui évite ces difficultés d’interprétation !

4) Certaines espèces bactériennes doivent attirer l’attention sur la probabilité de certaines pathologies sous-jacentes :
- Streptococcus gallolyticus ancien S. bovis type I, se rencontre presque toujours lorsqu’il y a des lésions coliques, en particulier des cancers du colon,
- les Streptocoques dits "viridans", les entérocoques, se rencontrent essentiellement lors d’endocardites infectieuses du cœur gauche,
- les Staphylococcus epidermidis, lorsque ce ne sont pas des contaminants, se rencontrent souvent lors d’endocardites du cœur droit (porteurs de pacemaker, en particulier)...

TECHNIQUES BACTERIOLOGIQUES

Transport
Idéalement, les hémocultures doivent être mises à incuber à 36° C dans les minutes qui suivent leur ensemencement.

Mise en culture
Elle est effectuée par le personnel infirmier (ou, mieux, par le technicien), au lit du malade par injection immédiate du sang prélevé dans le bouillon de culture.

Milieux ensemencés
C’est le bactériologiste qui choisit le type de flacons mis à la disposition des services.
Quelques industriels, chacun avec quelques produits, se partagent le marché. Actuellement, tous leurs milieux sont de bonne, voire d’excellente qualité. Le choix du type de milieu sera donc fonction des bactéries qu’on isolera le plus fréquemment dans les pathologies que l’on est amené à recevoir. En effet, certains milieux peuvent favoriser (discrètement mais significativement) telle ou telle espèce bactérienne.

Il est aussi envisageable de fabriquer soit même ses milieux de culture. Ils n’auront as les qualités très pointues des milieux commerciaux modernes mais, bien réalisés, ils permettront la culture de 95 à 100 des germes que l’on peut rencontrer dans des dispensaires isolés.


notes

[1on ne peut "espérer" voir des bactéries directement dans une goute de sang examinée au microscope que dans les phases terminales de la peste et du charbon. On peut également en voir lors de borrélioses africaines mais c’est très exceptionnel

[2un flacon s’ouvre toujours le plus prêt possible de la flamme du bec, en tournant le goulot vers la flamme pour limiter les projections microscopiques de liquide contaminé. Il est vivement conseillé de porter un masque et des lunettes. Les gants latex sont plus dangereux qu’utiles (risque d’inflammation et brulures graves).

[3ce "lavage" des bactéries est nécessaire lorsqu’elles ont poussées dans un milieu contenant des glucides si non ces glucides empècheront la bonne fixation des bactéries qui seront éliminées lors des multiples rinçage du Gram.

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