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>>Test d’Emmel : recherche hémoglobine S dans la drépanocytose

20 janvier 2015
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La recherche d’hémoglobine S (Hb S) est utilisée pour le diagnostic de drépanocytose.

Principe

La drépanocytose est une maladie génétique due à une anomalie (située sur le chromosome 11) du codage de la synthèse de la chaine béta de l’hémoglobine (Hb) : le chromosome normal a un allèle [1] qui synthétise une Hb dite Hb A, le chromosome drépanocytaire synthétise une Hb S [2]. C’est allèles sont codominants c’est à dire que si on possède l’allèle A sur un chromosome 11 et le S sur le second chromosome 11 il y aura synthèse et d’Hb A et d’Hb S.
On peut donc présenter les 3 combinaisons chromosomiques suivantes :
- Hb A-Hb A : individu normal,
- Hb S-Hb S : individu malade homozygote,
- Hb A-Hb S : individu porteur du gène mais ne présentant pas ou peu de signes de maladie bien qu’il porte des hématies anormales (puisque gènes codominants).

La forme homozygote de la drépanocytose présente des signes cliniques importants et assez typiques. Son diagnostic nécessite peu une confirmation biologique (sauf dépistage chez le nouveau né).
La forme hétérozygote (Hb A-Hb S dite "trait drépanocytaire") ne présente habituellement pas ou peu de symptomatologie clinique spontanée et typique. Il est donc important de la déceler, en particulier pour des conseils d’eugénisme.

Les moyens biologiques les plus fiables pour établir ce diagnostic sont l’étude de l’hémoglobine par électrophorèse ou par chromatographie liquide haute performance (HPLC) mais ceci nécessite un équipement cher, de maintenance délicate et coûteuse et l’achat des réactifs.
Le test de falciformation ou test d’Emmel est un bon procédé alternatif à condition de respecter exactement le mode opératoire.
Son principe consiste à provoquer entre lame et lamelle de microscope la désoxygénation (réduction) totale de l’échantillon de sang à examiner : l’hémoglobine S se polymérise alors sous forme de cristaux insolubles allongés qui déforment des hématies (voir photo). Cette déformation est facilement observable au microscope, grossissement x 40.

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Techniques

3 possibilités : avec ou sans réactif au métabisulfite ou avec suspension de selles :
- avec métabisulfite (substance réductrice) : plus rapide, plus fiable mais nécessitant ce réactif,
- sans métabisulfite, avec du vernis à ongle : plus lent, moins fiable (faux négatifs) mais moins cher,
- avec une suspension de selles : cette technique est décrite tout en bas de cette fiche sous le titre "Variante".

Matériel

Dans tous les cas :
- lame et lamelle,
- microscope.
Avec métabisulfite :
- réactif au métabisulfite,
Sans métabisulfite :
- vernis à ongle (ou paraffine).

Prélèvement

- Soit sang prélevé sur EDTA depuis moins de 2 heures,
- soit sang capillaire (voir prélèvement de sang capillaire) du bout du doigt (talon chez le nourrisson) mais, de préférence, mettre un garrot 4 à 5 minutes à la base du doigt avant de piquer : ceci diminue la pO2 veineuse et donc augmente la falciformation.

Réactif

Solution de métabisulfite de sodium (S2O5Na2) à 2 % (2 grammes pour 100 ml) dans l’eau : dissoudre 40 mg de métabisulfite de Na dans 2 ml d’eau ou 100 mg dans 5 ml d’eau.

Attention : cette solution doit être préparée extemporanément : elle ne se conserve pas pendant plus de 2 heures. Il est donc conseillé de réaliser les analyses par séries.

Réalisation du test

Dans tous les cas il faut manipuler rapidement pour éviter l’oxygénation du sang.

1) Avec réactif : mettre une très petite goutte de sang (environ 5 µl) sur une lame, juste à côté ou dessus, mettre une goutte environ 4 fois plus grosse (environ 20 µl) de réactif. Mélanger rapidement mais soigneusement.
Aspirer environ la moitié du liquide [3].
Couvrir rapidement d’une lamelle sans faire de bulles d’air. Laisser reposer 30 minutes dans une petite chambre humide (voir Réalisation d’une chambre humide). Rechercher la falciformation au microscope, objectif 40.
Si le résultat est négatif, examiner de nouveau 2 h plus tard.
S’il est encore négatif, de préférence luter la lamelle avec du vernis à ongle, puis examiner 24 h plus tard.

2) Sans réactif, avec vernis à ongle (ou paraffine) : mettre une très petite goutte de sang (environ 5 µl) sur une lame, juste à côté ou dessus, mettre une goutte environ 4 fois plus grosse (environ 20 µl) de sérum physiologique (eau avec 9 g/l de sel). Mélanger rapidement mais soigneusement.
Aspirer environ la moitié du liquide.
Couvrir rapidement d’une lamelle sans faire aucune bulle d’air. Recouvrir les 4 bords de la lamelle de vernis à ongles pour que l’oxygène ne puisse absolument pas pénétrer.
Observer au microscope objectif 40 à 1 heure puis à 2, 6 et 24 heures si on n’a pas vu d’hématies falciformes.

Dans tous les cas, si vous ne voyez pas d’hématies falciformes d’emblée, observer plusieurs zones car la falciformation est progressive et n’est pas homogène.

- Le test est négatif si les hématies conservent leur forme ronde.
- Le test est positif si les hématies prennent progressivement une forme de faucille, de feuilles de houx, de banane aux extrémités pointues, souvent dentelée.
- Le test est positif pour le portage du trait drépanocytaire si quelques hématies sont en faucille (et qu’il n’y a pas de signes cliniques).
Un sujet sain possède moins de 1 % de cellules falciformes.

Attention

Ne pas confondre hématies falciformes avec hématies crénelées (échinocytes) ou hématies ovales : les hématies falciformes ont toujours une ou deux extrémités pointues, alors que les ovales ne sont pas pointues et que les échinocytes (aspect "en oursin") ont de multiples petites pointes [4].

Causes d’erreurs

- échantillon de sang prélevé il y a plus de 2 heures,
- solution de métabisulfite préparée depuis plus de 2 heures (ne se conserve pas, même au froid),
- sang pas assez dilué (les hématies falciformes peuvent être masquées par les autres hématies) ou trop dilué (hématies falciformes trop rares et donc pas vues).

Pour vous exercer / contrôle de qualité

Si vous pratiquez dans un pays où sévit le paludisme, vous avez probablement un(e) ami(e) ou connaissance qui présente une drépanocytose. Demandez lui de vous permettre de faire le test chez lui.
Ce sera encore mieux si vous pouvez faire le test chez sa mère (pas chez le père. Il y a toujours un doute...). Si elle ne présente pas de drépanocytose clinique, elle possède forcément le trait drépanocytaire : chez elle, le test d’Emmel doit être positif.

Variante avec suspension de selles

Cette technique nous a été rapporté oralement et aurait été trouvée dans un ouvrage ancien.
Elle est basée sur le principe que le développement de bactéries réduit fortement le milieu.
Nous ne l’avons pas essayé personnellement mais elle pourrait donner de bons résultats.
A ce jour (15/06/15) elle a été essayé comparativement (métabisulfite versus suspension de selles en sérum physiologique (eau + 9 g/l de NaCL)) chez 28 consultants par Ibrahim Diakité (technicien à Sanga, Mali). Trois présentaient des drépanocytes avec les deux méthodes et 41 n’en présentaient pas avec les deux méthodes : voir ici.

- Mettre en suspension un petit poids de selles dans environ 5 ml d’eau peptonée ou autre bouillon de culture ou, même, de sérum physiologique.
- Centrifuger à environ 2 000 tours par minute (pour un rotor de 20-25 cm) pendant 2 à 3 minutes (centrifugation destinée à éliminer les matières fécales mais sans sédimenter toutes les bactéries).
- Utiliser le surnageant comme si c’était une solution de métabisulfite de sodium.


notes

[1l’allèle est la variation génétique d’un locus ou d’un gène. Par exemple les individus de groupe sanguin A ont l’allèle A, ceux du groupe B, l’allèle B, ceux du groupe 0 un allèle ne codant ni pour A ni pour B.

[2la différence entre Hb A et Hb S est infime : elle ne diffèrent que par le changement d’un seul acide aminé des chaines ß de l’hémoglobine : chez les malades une valine remplace un acide glutamique.

[3il est difficile de luter une lamelle posée sur plus de 10 - 15 µl

[4A part cette cause de faux positifs due à une mauvaise lecture, nous avons demandé au Pr. Patricia Martinez de Montpellier, grande spécialiste des hématies quel est le taux de faux positifs. Elle pense que cette donnée n’existe pas dans la littérature

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