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L’ensemencement de l’échantillon préparé préalablement (voir Prélèvement de crachat / expectoration) doit être effectué de telle sorte que la lecture des boites donne une idée de la concentration bactérienne du prélèvement.

Pour ce faire :
– on peut utiliser une technique semi-quantitative : l’isolement, à trois quadrants. On considère généralement que seules les colonies présentes sur le troisième quadrant correspondent à des germes présents en quantité pouvant être significative dans le prélèvement.
– on préférera une technique quantitative : on ajoutera à un volume d’échantillon 19 fois son volume de sérum physiologique (dilution au 1/20, donc dilution au 1/100 de la particule purulente qui a déjà été diluée au 1/5°). On mélangera énergiquement au Vortex (au moins 20 sc.). On déposera 0,1 ml de cette suspension au centre des géloses à ensemencer et on répartira au râteau, si possible avec un système faisant tourner la boite (ensemenceur rotatif). La sensibilité de cette méthode est de 1000 germes par ml de sécrétion bronchique, seuil que l’on considère généralement comme significatif. On évaluera facilement à l’œil, éventuellement par comparaison à une abaque (cf. numération d’Unités Formant Colonie (UFC) pour les urines) les plus fortes concentrations bactériennes, jusqu’à 1000 UFC, soit 1 000 000 d’UFC par ml de prélèvement. On s’efforcera d’apprécier ce nombre pour chaque espèce présente.

Les milieux à ensemencer sont :
– gélose Trypticase Soja ou Columbia, au sang frais de cheval ou de mouton (GTS au sang). On déposera un disque d’optochine sur le premier quadrant ou au centre de la boîte si ensemencée au rateau,
– gélose au sang cuit avec Polyvitex ou Isovitalex (dite "gélose Chocolat"),
– éventuellement, gélose Chocolat avec Bacitracine pour favoriser les Haemophilus.

Ces milieux seront incubés à 36° pendant 24 puis 48h (sous CO2 et en saturation d’humidité pour les géloses au sang cuit).

Ensemencer éventuellement :
– si on recherche des levures, gélose Sabouraud chloramphénicol ou, mieux, un milieu chromogénique permettant au moins l’identification directe de Candida albicans. Elle sera incubée à 30° pendant 48 h,
– gélose de type Bromo Crésol Pourpre (BCP) ou "milieu chromogénique pour les urines" si on recherche des entérobactéries ou des Pseudomonas tout en craignant la présence de P. mirabilis.
– gélose Columbia au sang, dégazée, pour recherche d’anaérobies si cette recherche à été spécifiée par le clinicien.

– Lecture après 24h :

de façon générale :
– ne pas tenir compte des espèces provenant habituellement de l’oropharynx sauf si elles sont abondantes et en culture quasiment pure : streptocoques viridens et non hémolytiques, staphylocoques coagulase négative, Haemophilus autres que influenzae, bactéries corynéformes et Neisseria non dominants.
– Les bactéries significatives et en quantité significative, correctement isolées seront identifiées et antibiotypées (cf. infra : identification et antibiogramme). Celles mal isolées seront réisolées.

– sur GTS au sang :

• repérer si la pousse est différente autour du disque d’optochine. Si c’est le cas, il faudra rechercher très attentivement les pneumocoques ;
• rechercher les colonies présentant un aspect de pneumocoque (hémolyse partielle ou non visible (parfois seulement sous la colonie), aspect en roue ou en pneu, parfois ombiliquée ou, au contraire, colonies très muqueuses, en goutte de rosée) et contrôler à l’examen microscopique l’aspect en diplocoque plus ou moins en flamme de bougie et la présence de capsule (inconstamment visibles sur les pneumocoques de crachats) ;
• rechercher les colonies bêta hémolytiques (hémolyse complète). S’assurer que ce sont des streptocoques (chaînettes de cocci, catalase négative (attention de ne pas emporter du sang de la gélose lorsqu’on fait cette réaction)). Si oui, si elles sont rares, les réisoler sur une nouvelle gélose au sang, si elles sont abondantes, les sérotyper et, éventuellement, les identifier ;
• rechercher Staphylococcus aureus, Branamella catarrhalis (à ne pas confondre avec des Neisseria !), entérobactéries et Pseudomonas (si abondants).

– sur Chocolat Polyvitex :
ce milieu permet la culture des Haemophilus et, plus généralement, des germes exigeants ;

• observer la flore totale (aspect des colonies, coloration de Gram ou lame/lamelle sur chaque type de colonie). Noter l’ordre d’importance des colonies de différentes espèces et le nombre d’aspects ;
• rechercher les colonies d’Haemophilus influenzae ;
• rechercher des colonies de Neisseria meningitidis et de Branhamella catarrhalis.

– sur Chocolat Polyvitex Bacitracine :

• ce milieu est assez spécifique des Haemophilus par inhibition d’autres bactéries.

– Lecture après 48h :

– lire à nouveau les milieux ensemencés ; vérifier que de nouveaux types de colonies n’y sont pas apparus. Si c’est le cas, pratiquer comme la veille.
– lire les repiquages de la veille ; vérifier le bon isolement des colonies (lame/lamelle ou Gram) ; identifier et effectuer les antibiogrammes pour les bactéries intéressantes (cf. : identification et antibiogramme).

– Lecture après 72h (ou plus) :

lire les milieux ensemencés à 48h ; vérifier le bon isolement des colonies (lame/lamelle ou Gram) ; identifier et effectuer les antibiogrammes pour les bactéries intéressantes (cf. : identification et antibiogramme).

Identification et antibiogramme

Une identification bactériologique précise et éventuellement un antibiogramme ne seront effectués que pour les germes réputés pathogènes ou les germes généralement commensaux mais en grand nombres dans le prélèvement et surtout largement dominants.

Ne s’intéresser à Candida albicans et autres levures que si elles sont massivement présentes dans le prélèvement.

Pour les autres germes habituellement non pathogènes et présents en petite quantité dans le prélèvement, on se contentera de signaler leur présence au clinicien sans les avoir identifié précisément. On peut aussi, pour ces germes, répondre : "germes banals" et signaler le nombre de souches présentes.