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>>Stérilisation : autoclave et four Pasteur (Poupinel)

16 novembre 2015
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Niveau de mise à jour : 4

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GENERALITES

Le but de la stérilisation d’un objet est la destruction ou l’inactivation irréversible de tous les micro-organismes qui se trouvent dans ou sur cet objet. Dans un objet stérilisé, aucun germe ne peut donc plus être décelé : il est stérile. Étant donné qu’un objet stérile sera re-contaminé par contact avec le milieu extérieur, une première exigence est de conditionner l’objet avant stérilisation.

  • Ce n’est qu’au moment de son utilisation, au tout dernier moment, qu’il sera déballé de manière aseptique. Le conditionnement et le mode de conservation du matériel stérile font intégralement partie de la stérilisation.

Nous ne traiterons ici que la stérilisation par la chaleur :
- les procédés par antiseptiques sont aléatoires (quant au résultat) et souvent dangereux : on ne doit les utiliser que lorsque la fragilité du matériel interdit la chaleur,
- les procédés par irradiation sont évidemment hors de portée d’un centre de santé.

On peut stériliser par la chaleur humide : autoclave (ou, à la rigueur et seulement pour le laboratoire, cocotte-minute), ou par la chaleur sèche : four Pasteur souvent dit « Poupinel ».
La stérilisation par la chaleur humide donne de meilleur résultats (en particulier c’est la seule utilisable pour détruire les prions de façon fiable), est plus rapide, peut se contenter d’une source de chaleur au gaz (les fours sont électriques) et consomme moins d’énergie. C’est donc ce procédé que nous conseillons et le seul légalement autorisé pour les objets utilisés en thérapeutique (instruments chirurgicaux, pansements...).

L’efficacité de tous les procédé de stérilisation dépend de la propreté initiale de l’objet à stériliser, donc de sa préparation.

PRÉPARATION DU MATÉRIEL

Si le matériel à stériliser est fortement contaminé, la stérilité ne peut être garantie.

La préparation du matériel se fait en étant muni de solides gants de ménage, de lunette et de préférence d’un masque.
- Décontaminer le matériel pour que sa manipulation soit la moins dangereuse possible. Pour cela le laisser tremper au moins 2 heures (une nuit si possible) dans une solution d’eau de Javel, dans un récipient (cuvette, sceau) fermé par un couvercle.
- Laver soigneusement, au savon et à la brosse le matériel. Si ce sont des tissus, les laver comme n’importe quel vêtement.
- Rincer soigneusement le matériel.
- De préférence le faire sécher, si possible au soleil mais sous un linge léger pour qu’il ne s’empoussière pas.
- L’emballer selon les caractéristiques du matériel (boite métallique à stériliser, sachets de papier fort...).
- Fermer les emballages de façon adéquate (ouvrir les évents des boites à stériliser et mettre un papier collant indicateur de température si on en dispose entre fond et couvercle, scotcher les sachets papier avec un papier indicateur de température si on en dispose, visser le bouchon des flacons puis desserrez le bouchon d’un quart de tour pour qu’ils n’explosent pas...).

La stérilisation ne se limite donc pas à un simple traitement dans un stérilisateur. Le nettoyage préalable et l’emballage, font partie intégrante d’une opération de stérilisation.

STÉRILISATION PAR LA CHALEUR HUMIDE

Introduction :
La stérilisation à la chaleur humide au moyen de vapeur saturée et sous pression (pour atteindre la température nécessaire) constitue le procédé de stérilisation le plus fiable et le plus facile à contrôler La stérilisation à la vapeur sous pression représente donc le premier choix pour le matériel qui résiste aux températures de 120 à 134° C et à l’humidité.

Principe
Le matériel à stériliser est exposé à l’action de la vapeur d’eau saturée et sous pression avec des paramètres temps/température déterminés. Les objets à stériliser peuvent être placés sur des grilles, plaques perforées ou dans des conteneurs perméables à la vapeur.
Les températures à atteindre sont en principe de 120° C pour détruire les bactéries et de 134° C pour les prions.
En pratique, pour le matériel et les réactifs de laboratoire, une température de 116 à 118° C peut suffire. En effet, le problème des prions ne se pose pas (sauf dans des laboratoires spécialisés dans ce domaine) et aucune bactérie végétative ne résiste à cette température. Seules quelques spore bactériennes pourront survivre à 116 ° C mais elle sont exceptionnelles.

Mode opératoire :
Le matériel à stériliser, parfaitement propre, doit tout d’abord être emballé. On utilise normalement des boîtes en inox à volets. A défaut, on utilise du papier. Le meilleur papier est le papier kraft épais et le papier journal vierge (voir avec les quotidiens locaux pour l’approvisionnement). En pratique, on emballe les produits à stériliser dans deux ou trois épaisseurs de papier. On fermera les sachets en les repliant plusieurs fois. Le pliage sera maintenu soit avec du papier collant pour autoclave soit avec un trombone.
Le conditionnement doit être perméable à la vapeur d’eau. La fonction de protection du conditionnement et le séchage du matériel ne peuvent être compromis par la condensation.
La stérilisation de tubes en verre de 15 ml (contenant 5 ml d’eau ou de sérum physiologique) ne nécessite pas d’emballage : après avoir désinfecté puis rincé soigneusement les tubes, les remplir près du bec Bunsen de 5 ml d’eau déjà filtrée ou de 5 ml de sérum physiologique (préparé avec 1 litre d’eau filtrée et 9 grammes de sel). Flamber les cols des tubes puis les boucher sans les visser à fond : la vapeur d’eau doit pouvoir circuler pour éviter une surpression qui ferait exploser les tubes. Les placer verticalement bouchon en haut dans un panier en métal puis dans l’autoclave. A défaut d’un autoclave, on peut utiliser une Cocotte-minute dont la température ne monte qu’à 116 ou 118 ° C selon les modèles. Il existe cependant des petits autoclaves de 8 litres avec manomètre de contrôle de la pression (cocotte norvégienne) à environ 300 Euros (200 000 FCFA).

Stérilisation proprement dite :

  • Placer les boîte en inox, volets ouverts, ou les paniers contenant les tubes dans l’autoclave contenant de l’eau (environ 1 litre pour un autoclave de 8 litres, il doit en rester au fond en fin de processus). Fermer hermétiquement l’autoclave.
    L’eau ne doit pas toucher les boîtes ou les tubes. Au besoin, placer 3 ou 4 galets au fond de la cocotte pour surélever le panier.
  • Placer l’autoclave sur la source de chaleur, la soupape d’évacuation d’air étant ouverte. Dès l’apparition de l’ébullition, diminuer le chauffage pour permettre à l’air et à la vapeur de s’échapper doucement.
  • Après une vingtaine de minutes, fermer la soupape d’évacuation de l’air. Tout l’air doit avoir été évacué et remplacé par la vapeur d’eau pure.
  • Augmenter le chauffage et surveiller le manomètre. En quelque minutes, il atteint 1 bar. 1 bar pour de la vapeur d’eau pure » correspond à une température de 120° - 121° C.
  • Diminuer le chauffage pour maintenir la pression entre 1 et 1,2 bars pendant 20 minutes (pour des tubes de liquide) puis couper le chauffage.
  • Pour des produits où la chaleur pénètrera plus lentement que dans des tubes de liquide, poursuivre le chauffage pour que la température au sein de la masse à stérilisée atteigne 120° pendant 20 mn.
  • Si on veut obtenir à la fin un séchage (valable pour les emballages papier), laisser fuir rapidement la vapeur par la soupape puis ouvrir l’autoclave dès que la pression est tombée (attention aux brûlures par la vapeur) et laisser sécher le panier à l’extérieur de l’autoclave.
  • Si on stérilise des liquides, laisser la pression tomber sans ouvrir la soupape, si non, ces tubes ou flacons n’étant pas fermés hermétiquement comme dit plus haut, le liquide va bouillir et les tubes seront plus ou moins vides à la fin ! Et si les tubes sont hermétiquement fermés, quelques uns ou probablement tous, vont exploser !.
    Lorsque la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrir l’autoclave, sortir tubes et bouteilles, serrer les bouchons immédiatement (manipuler avec des gants épais : attention aux brûlures). On peut également, si on a le temps, attendre le refroidissement complêt de l’autoclave et de son contenu. C’est plus sûr et moins dangereux.

Attention, la durée de 20 minutes est le temps suffisant, à 120°C, pour détruire les spores bactériennes là où se trouvent ces spores. Il faudra donc augmenter le temps d’autoclavage si le produit à stériliser est massif (gélose en flacon par exemple) ou isolant (blouses chirurgicales pliées par exemple) ou dans un emballage isolant (papier d’aluminium par exemple).
En pratique, on conseil de compter une heure à 120° C ou 1 bar pour du petit matériel (tubes, flacons de 250 ml…) et 2 heures pour des objets plus massifs. Si les produits ne craignent pas la chaleur il vaut mieux compter plus que moins longtemps ! Attention pour la stérilisation des milieux de culture préparés à partir de poudre de base : ils sont toujours plus ou moins altérés par la chaleur donc bien lire la notice et bien tenir compte de ses indications.

Pour contrôler le processus on peut utiliser des étiquettes ou des bandes de papier collant dont l’encre vire de couleur à certaines températures. On peut ainsi savoir à quelle température est soumis l’intérieur de la cocotte et en déduire le temps de chauffage nécessaire. Ces bandes seront systématiquement placées pour valider la stérilisation.
Attention : il existe des indicateurs pour chaleur sèche et d’autres pour chaleur humide. Ils ne virent pas aux mêmes températures. Donc, ne pas se tromper d’indicateur !

Pour les agents non conventionnels (prion de l’encéphalite spongiforme bovine : ESB), on doit chauffer 20 minutes à 134 °C là où ils risquent de se trouver.

Procéder ensuite au rangement du matériel stérilisé :
La conservation du matériel stérilisé est primordiale pour garantir une stérilité constante dans le temps.
Lorsque l’on sort les boîtes de la cocotte, les ouïes d’aération sont immédiatement fermées. Il est conseillé de mettre un petit bout de papier collant dessus pour écrire au marqueur indélébile la date de la stérilisation.
Il est déconseillé d’utiliser des produits ou matériels stérilisés après plus de 3 mois de stockage encore que cette durée puisse être théoriquement portée à l’infini si rien n’a pu favoriser une recontamination.
Les tubes d’eau et de sérum physiologique sont conservés dans un petit carton à l’abri de la lumière. L’apparition d’un trouble dans un tube, signe de pousse bactérienne, entraînera le rejet de son utilisation c’est pourquoi il est toujours préférable de garder les tubes et autres milieux de culture quelques jours avant utilisation pour vérifier l’absence de trouble.

STÉRILISATION PAR LA CHALEUR SECHE

Comme dit précédemment, la chaleur sèche est déconseillée.
Cependant, si on doit l’utiliser pour des matières sensibles à l’humidité, les paramètres de contact des bactéries avec la chaleur sont de 180° C pendant 2 heures. L’air transmettant moins bien la chaleur que la vapeur d’eau saturante, le temps de mise en température des objets massifs ou plus ou moins isolants doit être plus long qu’en chaleur humide.


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